中药现代化二十年 资源篇 中药资源领域新理论新技术

一、药用植物亲缘学

药用植物亲缘学是一门综合了植物系统及分类学、植物化学、药理学和信息学的多学科渗透交叉的学科。1978年肖培根首次提出植物亲缘关系、化学成分和疗效间存在内在规律的药用植物亲缘学概念，引起了各国的瞩目和反响，由此揭开的药用植物亲缘学的研究热潮。通过研究重要药用植物类群的亲缘关系-化学成分-药理活性及传统疗效进行系统研究和整理，通过对它们的“共性”和“个性”分析，总结药用植物资源的应用经验，最终形成具有创新性的“药用植物亲缘学”基础理论。

药用植物活性成分大都属于植物的次生代谢产物，在植物的进化过程中形成了相应的亲缘关系，亲缘关系相近的植物不仅体现在形态上，也体现在其功效和药理作用上。由此反映在其所含化学成分质和量的相似性。通过对药用植物中重要活性成分如生物碱、黄酮类、萜类、香豆素类等分布规律的归纳，对重要植物类群进行系统整理，结合传统疗效和现代药理作用，特别是采用数量分类学和信息学的方法和技术先后对茛菪类、小檗类、大黄类、乌头类、芍药类、黄连类、唐松草类、紫草类、蒲黄类和杜鹃花类等重要药用植物类群进行了综合性和研究，揭示了其植物亲缘关系-化学物质基础-疗效间的相互关系及内在规律，形成了药用植物亲缘学的基本理论，建立了相应的研究方法和方向。其研究主要集中在以下几个方向：植物形态学（广义）和分子系统学的研究；植物化学特征及其生物合成途径的研究；化学成分在植物系统中的分布规律研究；化学系统学研究；药用植物疗效与化学成分和系统学位置相关性研究；药用植物亲缘学的信息学及智能科学的研究。

药用植物亲缘学的研究方法和关键技术包括以下几个方面:选择合适的数学模型，建立智能数据库；实验分类学、分子分类学、数量分类学与现代信息学技术的结合；现代分析技术手段与生物活性物质筛选的结合；以现代信息学技术为基础的多学科信息的整合。药用植物亲缘学的研究意义体现在以下几个方面：促进药用植物新资源的发现；寻找进口药物和濒危稀有药用植物替代资源；丰富中药现代化的基础研究内涵；为新药开发提供新的理论和方法。

近20年来，药用植物亲缘学的研究越来越多，如唇形科、百合科、苦苣苔、三白草科、菊科等药用的植物的亲缘学研究的发表。药用植物亲缘学作为一种创新理论对中药及药用植物的资源利用、大规模筛选、设计及开发中药新药具有重要的指导意义，并形成传统经验与现代高新技术相结合的药物研发新模式和新方法。随着分子生物学技术的不断发展，基因组学，代谢组学和相关技术的涌现拓展了对中药资源和药用植物亲缘关系的视角，促进了研究模式的转换，药用基因组亲缘学也将由概念走向成熟的理论。

二、植物化学分类学

植物化学分类学是植物分类学与植物化学相互渗透、相互补充、互为借鉴而形成的一门新兴的边缘学科。它以植物化学成分为依据，以经典分类学为基础，对药用植物加以分类和记述，研究植物化学成分与植物类群间的关系，探讨植物界的演化规律。其重点是阐述各药用植物各类群的化学特征，探讨植物化学成分在植物界的存在和分布规律；分析它们在分类学和系统学上的意义。

植物化学分类学学科的形成与发展至今，其研究范畴更加扩展，研究任务不断深入，更为强调植物的系统发育与其化学物质组成和积累的关系，积极探索植物的系统发育与化学成分关系的规律性。结合前人的研究积累和药用生物资源研究、开发利用的实际需要，提出植物化学分类学的研究范畴及其任务：研究各植物类群的化学成分，包括初生代谢及次生代谢产物，确定其结构，并应考察其含量。探讨植物化学成分在植物界的存在和分布规律，分析它们在分类学和系统学上的意义。了解植物化学成分的生理作用，合成、转化、动态积累及与个体发育和系统发育的关系。综合相关领域的研究思路、方法和信息积累，从植物化学分类学角度探讨物种形成、种的变异和植物界的系统演化规律。

植物化学分类学不仅是经典植物分类学的补充和发展，而且在药用植物资源的开发利用及寻找新资源中起着重要作用。研究的对象可选择分类系统中的关键类群、争议较大的类群、中国特有的类群等；可研究大系统大类群的演化，也可研究种下等级的化学变异。中药资源领域的植物化学分类学研究工作的另一个重要方面是根据经济社会发展需求研究社会效益或经济效益较大的资源类群，可选择某些稀有和具有重要资源价值的化学类型及成分，追踪其在植物界的分布规律，寻找新资源和发现新的可替代性资源，扩大植物资源利用途径等。

三、分子生药学

分子生药学是在分子水平上研究生药的分类与鉴定、栽培与保护及有效成分生产的一门科学,是生药学的一个极富前瞻性和前景性的分支。自从1995 年黄璐琦在《中国中药杂志》上发表《展望分子生物技术在生药学中的应用》一文，首次提出“分子生药学”的概念以来,已经经历了近20 年的发展。现在,分子生药学在研究内容、技术方法、获得成果、人才队伍等方面日趋成熟,已经成为生药学中一门新兴的交叉学科,表现了巨大生命力和活力。

分子生药学的产生,一方面将生药的研究层次向微观推进到基因水平,极大地丰富了以往对生药生命现象的认识；另一方面,由于不同基因或DNA片段的进化速度不同,其在进化中的特殊地位不同,所反映的遗传变异的尺度和水平也不同,这一点强化了人们对生药细胞、组织、器官、有机体、种群等层次的重新认识和思考，逐渐形成了药用植物分子系统学、药用植物分子谱系地理学、生药分子鉴定、道地药材形成分子机制、珍稀濒危中药资源的遗传多样性分析与保护研究、药用植物次生代谢产物的生物合成和代谢调控、药用植物功能基因组研究、药用植物有效成分的合成生物学研究、药用植物的转基因研究、药用植物的分子育种研究、药用植物细胞及真菌培养生产活性成分等11个稳定的研究方向。

先后提出了在遵循分子系统学研究结果的基础上，采用个案分析方式，建立中药分子鉴定方法的中药分子鉴定原则；从生物学上说，道地药材的形成是基因型与生境之间相互作用的产物，并提出了道地药材形成的三个模式假说；遵从传统遗传学和溯祖理论开展药用植物居群遗传和微观演化研究，为中药材野生资源保护、道地药材形成生物学机理等研究提供理论支撑；从分子生药学角度探索药材活性成分变异及其质量控制，提出了重复基因功能分化决定药用植物活性成分变异的理论，道地药材形成的表观遗传学理论等。

四、本草基因组学

本草基因组学（Herbal genomics）是研究草药基因组的组成，组内各基因的精确结构、相互关系及表达调控的科学，是用于概括涉及基因作图、测序和整个基因组功能分析的遗传学分支。我国研究人员已经开始通过对中草药基因组测序、组装并注释基因组来分析各基因的功能，以为揭示中草药的遗传背景和通过阐释中草药有效成分生物合成途径进行分子育种奠定基础。目前，灵芝、丹参、茯苓、云芝、紫芝、石斛、莲、赤小豆等药典刊载物种已经完成基因组测序并发表。

2015年科学杂志（Science,Sup）以“本草基因组学-揭秘传统草药生物学本质”为题正式系统介绍了本草基因组学。本草基因组学为复杂草药成分的化学和生物学解析提供了有效平台，通过建立基因数据库可被广泛应用于传统草药的品质研究、分子鉴定、有效成分的生物合成、道地性研究和分子育种等。

本草基因组作为通过基因组学研究药用生物次生代谢产物生成特性及道地药材形成基础的新兴学科仍面临着机遇和挑战。随着新测序技术的迅猛发展，越来越多的药用生物基因组、转录组信息将被揭示，在提供遗传背景的同时，其组装中的错误也应获得足够重视。目前测序方法存在缺陷，对于长片段的重复序列仍然不能很好分辨，造成基因组拼接的碎片化，并容易引入错误。更长更精准的测序平台及拼接方法依然是推动本草基因组的核心。基因组学与现代分子生物学、代谢组学、植物学及生态学结合将更好的阐明药用生物次生代谢产物形成机制及道地药材形成的生物学机制，为中药研究提供崭新的思路。

五、中药资源化学

段金廒教授及其团队在长期的科研实践中，逐渐形成了药用生物资源-资源性化学物质-资源经济产业链相互关联、互为支撑、循环利用、协同发展的系统性思维和中药资源化学理论及方法技术体系的创建，编著出版国内外第一部《中药资源化学-理论基础与资源循环利用》专著。为我国中药资源学理论和科学内涵的进一步丰富和完善作出了应有的贡献。中药资源化学是一门应用多学科知识与方法技术，以药用植物、菌物、动物、矿物等再生和非再生资源为研究对象，揭示其资源性化学成分的性质、分布、积累与消长规律，并通过适宜技术集成以实现中药资源的合理生产与科学利用的综合性应用基础学科。

中药资源化学的基本内涵是从资源学角度出发，研究中药资源中可利用化学物质（包括次生代谢产物和初生代谢产物）的时间、空间基本属性及其动态变化规律等；从化学物质的角度研究中药资源可利用物质的类型、结构、性质、质量、数量、存在与分布及其资源价值和利用途径等。中药资源化学学科的任务是服务于中药资源生产与利用全过程，以药用植物、菌物、动物、矿物等再生和非再生资源为研究对象，注重从中药资源的生产和利用目的出发，研究药用资源生物体不同生长阶段、不同组织器官中次生与初生代谢产物的生合成规律及其分布特征；研究生态环境诸因子影响资源性化学成分的积累动态与消长规律；研究濒危、珍稀、紧缺中药资源的替代和补偿；挖掘中药资源的多途径、多层次、精细化利用价值和潜在价值；研究中药资源产业化过程产生的传统非药用部位及深加工产品制造过程产生的固液废弃物等的循环利用与产业化；开展外来入侵药用生物的转化利用及其产业化等。其目的是将有限的资源更为有效的进行产业化，延伸资源经济产业链，获取最大的经济-社会-生态效益。

六、合成生物学

（一）合成生物学在中药现代化研究中的意义

中药是祖国医药学的重要组成部分，其药效物质基础是中药化学成分。通过中药化学及现代化的药理药效研究已经明确了一些常用中药的化学成分或者有效成分，并进行了较为深入的研究，例如青蒿中的抗疟成分青蒿素、麻黄中具有发汗平喘作用的麻黄素、丹参中的具有抗凝血、消炎抑菌作用的丹参酮等。这些化学成分大部分来自于药用植物的次生代谢产物，是植物在长期演化过程中适应性进化的结果，其显著特征是在植物中含量低且积累量不稳定，易受环境和气候等因素的影响、有些化合物结构复杂难以化学合成、性质不稳定，而近十几年来发展起来的基于合成生物学高效、定向地合成结构复杂多样的药用有效成分的研究策略有效地解决了许多在中药研究中遇到的问题，为中药资源的可持续利用以及中药现代研究提供了新的研究思路和研究策略。

（二）合成生物学发展

合成生物学最早出现于法国物理化学家Stephane Ledue所著《The mechanism of life》一书中，但是受限于技术和认知的水平，一直未得以发展，直到二十世纪七八十年代，快速发展的基因工程技术、基因测序技术以及组学分析技术为合成生物学的迅速发展奠定了基础。自2000年《自然》杂志关于第一个合成的生物振荡器及通过设计基因开关在大肠杆菌中构建了人工双稳态基因调控网络的报道开始，合成生物学进入了快速发展时期，被广泛应用到了环境、医药、能源、化工、材料和农业等各领域。

合成生物学近十几年迅速发展起来，并取得丰硕的成果，在中医药方面的应用代表了中药现代化的最新成果。合成生物学在药用植物领域最具代表性的研究成果为青蒿素，目前在酵母基因工程菌中生产青蒿素的前体青蒿酸已达到25g/L的产业化水平，这是药用植物有效成分合成生物学生产中引人注目的成就。而2015年8月发表在Science杂志上的成果，将植物、动物以及细菌的二十多个基因混合导入酵母中，成功的生成了吗啡等止痛药物的前体——蒂巴因，这一成果成为了合成生物学研究的又一重大里程碑。国内，合成生物学在丹参中丹参酮的研究中也取得了重大突破，随着丹参酮生物合成途径的不断推进，分别构建了高产丹参酮结构类似物酵母基因工程菌。另外人参皂苷元等的微生物生产及转化都代表我国在利用合成生物学技术和策略进行中药现代化研究的重要进展。随着深测序以及生物信息学技术的发展，越来越多药用植物有效成分的生物合成途径逐渐被解析，药用有效成分的合成生物学研究也得到了快速发展，相关研究成果不断涌现。

（三）合成生物学研究策略

利用合成生物学方法在微生物体内生产药用有效成分包括：生物元件的挖掘、生物合成途径的组装、代谢途径优化以及细胞全局性能优化四个阶段。随着高通量组学技术、高分辨质谱技术、生物化学、分子生物学等研究手段的日趋完善，药用活性成分的合成生物学研究得到了飞速发展。

1.生物元件的挖掘  药用植物有效成分的合成生物学研究很大程度上取决于有效成分在药用植物中的生物合成途径的解析及其生物元件的挖掘。生物元件包括基础生物元件和特征生物元件，基础生物元件包括启动子、终止子、操纵子、核糖体结合位点等遗传系统中最基本的元件，在异源重构的过程中与特征生物元件组合配合其产生作用；特征生物元件是药用植物中特征有效成分生物合成途径的功能基因及其调控因子，是该药用植物所特有的，由于药用有效成分主要在特定的生长发育阶段、特定的组织部位积累，因此其功能基因表达的也存在一定的时空特异性。目前已经建立的许多基础生物元件的数据库，而特征元件的挖掘和功能鉴定是进行药用有效成分合成生物学研究的基础。

药用植物有效成分的生物合成途径十分复杂，往往涉及几个甚至几十个酶的参与。首先是催化途径的推测，根据有效成分以及代谢中间产物的结构来推测其代谢途径，已知的生物合成途径能够为未知代谢途径的解析提供基础，另外例如KEGG (http://www.kegg.jp/)、Metacyc(http://metacyc.org/) BRENDA (http://www.brenda-enzymes.org/)、FMM （http://fmm.mbc.nctu.edu.tw/）等代谢途径的预测和设计的数据库及生物信息学软件的逐渐完善，也可以为代谢途径的推测提供参考。对推测的生物合成途径可以利用放射性同位素标记实验进行验证；依据中间代谢物结构推测可能参与反应的酶，并进行筛选、基因克隆和功能研究。同源克隆、表达差异分离、图位克隆以及T-DNA标签技术是早期比较常用的功能基因克隆的策略。随着深测序技术的发展，测序成本下降，网络公共数据库不断完善，基于药用植物有效成分积累的时空特异性建立比较转录组文库，并对其进行比较分析，成为生物合成途径候选基因筛选克隆的快速有效途径。筛选出来的候选基因可以在体外或者体内对其功能进行验证，体外功能验证主要通过表达蛋白进行体外酶促反应，体内功能验证主要通过基因编辑、过表达或者RNA干扰等手段对其在来源植物中的功能进行分析。

2.底盘菌选择及催化元件和途径的组装  将获得的特征生物元件在合适的底盘生物中重构生物合成途径实现药用有效成分的异源生成，符合药用有效成分合成生物学研究的底盘生物要具备以下几个特征：1.生长迅速；2.遗传操作可行、简单；3.易于大规模培养；4.工业化操作简便。目前比较常用的用作药用植物有效成分异源生产的底盘生物有大肠杆菌、酵母以及烟草等。

生物合成途径的高效组装是实现药用有效成分合成生物学生产的关键技术，包括功能基因的组装以及生物途径的组装。一个有功能的基因主要包括带有核糖结合位点的启动子、基因的开放阅读框以及终止子。将元件组装成功能基因只是最基本的步骤，大多数药用植物有效成分的生物合成途径包括多个酶的催化过程，因此还需要进一步将功能基因组装成完整的生物合成途径。

生物合成途径的高效组装方法主要基于三种技术原理：连接酶拼接(ligase chain reaction)、聚合酶拼接(polymerase cycling assembly)以及同源重组(homologous recombination)。基于连接酶和聚合酶拼接的方法包括有：用于功能基因元件拼接和生物途径组装的BioBrick组装法以及其改进版BglBricks法、聚合酶环形延伸克隆（circular polymerase extension cloning，CPEC）、Golden Gate组装法、序列与连接酶非依赖型克隆（sequence and ligation-independent cloning，SLIC）以及用于大片段拼接的Gibson恒温一步法。酵母的高效同源重组系统为体内DNA大片段的快速组装提供平台。Gibson体内一步组装法和DNA装配器（DNA assembly）即是基于酵母的这一特性建立起来的。基于酵母重组系统的另一种方法是赵惠明研究组开发的DNA装配器，该方法已经被成功应用于组装木糖代谢途径和玉米黄质代谢途径以及两个途径的快速组装。Zhou等优化了该方法的模块制备过程，利用模块化途径工程技术（MOPE）实现了丹参酮代谢中间产物代谢途径在酵母中的快速组装。

各种DNA组装技术的开发利用让药用植物生物元件、代谢途径的途径的组装更高效快捷，但是不同的技术有不同的适用性和优势。随着技术的发展，更多的新技术和新方法正在不断涌现，根据不同的需要，选择合适的方法最重要。

3.代谢途径优化  将药用有效成分代谢途径组装至底盘细胞中实现了有效成分的微生物生成，但是要达到工业化生产的需求还需要通过代谢途径优化来提高产量。代谢途径的优化首先要保证前体的充足供给，可以通过增加限速酶基因的拷贝数、强化限制酶基因的启动子、进行密码子优化、筛选活性更强的同源基因等策略来增加前体供给。在萜类化合物的微生物生产中，过表达萜类生成上游MVA和MEP途径的关键酶基因能够显著提高目标产物的产量。除了高表达关键基因，抑制或者阻断竞争途径的代谢供给从而使更多的能量和代谢物流向目标终产物，也能大大提高产量。在青蒿酸酵母基因工程菌构建过程中，抑制竞争途径中鲨烯合酶基因的表达使得青蒿酸前体化合物紫穗槐二烯的产量提高了两倍。

关键基因的高表达是基础，但是从工程的理念上讲，需要代谢流和能量流实现最合理的配置，才能达到高效合成，因此合理的上下游途径的平衡也很重要。通过酶促动力学分析评估代谢途径中的酶的催化活性，从而调节酶的表达量达到调节代谢流的目的，最终可以提高产量。利用“多维模块策略”将代谢途径中的酶按照节点、催化效率等分成几个模块，在转录或者翻译水平上对这些模块分别进行调整，实现途径优化。研究人员利用该技术将紫杉二烯的上游途径（酵母中内源的生成IPP的途径）和下游途径（从IPP至紫杉二烯的外源途径）分别构建在不同的模块中，通过代谢调节最终使紫杉二烯的产量提高了约15000倍。Dai等在染色体整合了次丹参酮二烯生成的萜类合酶的酵母基因工程菌上，将上游前体合成途径分成两个模块，成功的提高了前体供给，将产量提高至488mg/L。除此之外，药用植物有效成分生物合成过程中的部分代谢中间产物对微生物存在一定的毒性，影响微生物生长以及产量，而将蛋白进行融合表达能够增加底物传递效率和降低中间产物的影响，次丹参酮二烯基因工程菌中，融合表达与独立表达以及不同的融合方式对终产物次丹参酮二烯均有较明显的影响。在酵母中融合表达来自拟南芥的4-coumaroyl-CoA连接酶和来自葡萄的芪合酶将白藜芦醇的产量提高了15倍。利用酶的支架技术或者将代谢途径整合至微空间一方面能够降低代谢中间产物的毒副作用，另一方面也能缩短间距，提高底物传递效率。将FPP合酶和倍半萜合酶定位至酵母线粒体中表达，使得倍半萜产量提高了8-20倍。

4.细胞全局性能以及发酵优化  代谢途径优化的过程，有些策略可能会影响到菌株的生长，另外有一些药用植物有效成分具有抗菌活性，对菌株的生长会产生影响，因此还需要在途径优化的基础上对细胞的全局性能进行优化，以提高菌株的生理性能和生态环境适应性。菌种驯化、全转录工程技术和高通量筛选等技术能够通过定向进化、加快基因组改造等方式高效筛选出生长迅速、耐药性高的菌株用于进一步的代谢工程改造。

发酵条件的优化能够进一步提高基因工程菌株的生物量从而达到提高产量的目的，利用生物传感器筛选最优的碳源和氮源浓度、pH值以及发酵温度等，用优化的发酵条件进行发酵能够显著提高菌株的OD值。针对代谢物对菌株生长有影响的情况，还可以通过分阶段培养来提高生长速度，将发酵分为生长阶段和产物积累阶段，另外还可以通过两相萃取发酵来提高产量，Dai等在人参皂苷元基因工程菌的发酵过程中发现，发酵一段时间后，发酵液上层产生了大量的黑色物质，在发酵过程中加入油酸甲酯进行两相萃取发酵，显著提高了人参皂苷元的产量。在单萜和倍半萜的基因工程菌发酵过程中利用两相萃取发酵同样可以大大提高产量。

2015年诺贝尔生理学或医学奖得主屠呦呦研究员发现了青蒿素的抗疟作用，为挽救全球数百万人的生命作出了突出贡献。该荣誉充分体现了中医药的巨大发展潜力和前景。青蒿素作为抗疟疾的重要药物，但由于青蒿素在黄花蒿中的含量低，化学提取的成本高。研究人员通过解析青蒿素的生物合成途径，利用合成生物学方法在酵母中大量生产青蒿素前体，利用化学转化获得青蒿素，该方法大大降低了青蒿素的获取成本。利用合成生物学方法在微生物中大量生产青蒿素的前体化合物，这一研究充分体现了合成生物学在中医药现代化中的作用，合成生物学将作为一个新技术和新策略为中药资源挖掘与可持续利用作出贡献。

七、中药整合质量观（中药大质量观）

中药质量评价与控制是保证中药安全有效的重要基石，但是目前评价指标碎片化、与临床功效和合理用药脱节等是当今中药质量评控主要的突出问题，同时也没有体现中医药本身的整体观和系统观特点。为此，肖小河教授首次提出中药整合质量观（Integrated Quality Control of TCMs,亦称中药大质量观），其核心的学术思想就是中药质-效-用系统评控，即“关联功效，综合评控，不唯成分论质量；量证相关，辨质用药，不就质量论质量。进一步地，首次创立了中药质量整合评控体系即“五级评控力金字塔”，根据与临床功效的关联性和评控力大小依次排序：效应成分指数＞生物效应评价＞多组分含量测定＞药材商品规格等级＞药典常规质量检测。该体系为推动中药精准质控和精准用药提供了新的策略和方法学支持。

具体来说，针对化学背景不明晰的中药，采用生物活性效价检测；针对化学背景相对清晰但药效物质不明确的中药，采用多组分含量测定；针对药效物质相对明晰的中药，建立整合化学分析和生物评价技术优势的中药质量综合评价方法——效应成分指数；针对化学检测和生物评价方法均未建立的中药材，建立以商品规格等级和道地性评价。

一、分子生药关键技术

双分子标记技术：针对分子鉴定中真伪鉴别有余，优劣评价不足的现象，以及中药材二维分子标记法构建中功能基因研究基础薄弱的情况，提出了基于DNA分子标记和代谢标识物相结合的双分子标记法。

中药系统鉴定：针对目前传统鉴定方法在中药鉴定过程中的不足(如多来源药材品种鉴定)，结合分子鉴定的技术优势与特点，提出中药系统鉴定法，其不仅从性状、显微、化学等“表型性状”方面揭示中药“种”的特征信息，还从其遗传物质DNA信息(基因型)的角度，更深层次的揭示“种”、“亚种”、“居群”等分类及演化关系等，为中药鉴定学科的深入发展，开拓了更广阔的研究领域。

分子鉴定的现场运用：针对中药材分子鉴别缺乏现场运用能力的问题，建立了中药分子鉴定现场运用体系，即包括药材DNA快速提取模块、DNA标记检测模块和保障模块，并配备了相应的自主开发试剂盒、仪器装备。运用这套系统对中药材及其饮片进行现场鉴别，可在40-60min完成，且仪器装置简单、易于操作，为传统中药现场鉴别手段的有益补充。

药用植物功能基因组：药用植物作为一个复杂的生物体,其起源、进化、发育、生理以及与遗传性状相关的研究伴随着药用植物功能基因组学的发展展现出蓬勃的前景。功能基因组研究包括基因组、转录组、蛋白质组、代谢组、表观组等,其中药用植物基因组研究为从分子水平上全面解析各种生命现象提供了前提和基础,极大地推动前沿生命科学技术在药用植物和中药领域的应用。大量药用植物转录组数据的发表,对于阐明药用植物有效成分的合成和调控奠定了基础,并促进药用植物遗传与环境交互作用机制研究的开展。后功能基因组时代,越来越多的证据表明,表观遗传修饰与物种间和物种内的表型变异有关,甚至从宏观上影响物种进化；而系统生物学是整合当前不断加速积累的海量生物学数据,揭示生物活动本质特征的重要工具。

药用植物生物工程技术：利用细胞工程、微生物工程、基因工程等技术手段生产药用植物次生代谢产物；克隆重要药用和农艺性状相关基因或分子标记，并运用于药用植物分子育种。

二、本草基因组测序与组装技术

在过去20年中，Sanger双脱氧酶法一直是测序技术的“金标准”。近年来，第二代高通量测序技术逐步成熟，新启动的测序计划多以第二代测序平台为主。由于药用植物丰富的多样性，不同物种的基因组大小和复杂程度可能千差万别，因此药用植物的全基因组测序可以根据经费预算和基因组预分析结果，灵活选择不同的测序平台或平台组合。在基因组较小的物种测序计划中可以选择GS FLX 或Illumina GA测序平台。对于复杂的植物大基因组可以选择两种或以上的测序平台进行鸟枪法和双末端(pair-end) 测序，同时构建大片段插入文库如BAC、Fosmid 等方法进行测序，然后对获得的数据进行组合拼接。目前，利用GS FLX 的鸟枪法测序完成基因组的初步组装,产生454contig，然后利用Illumina GA 或SOLiD 的双末端测序数据确定454 contigs之间的顺序和方向，形成scaffolds。最后利用Illumina Hiseq填充部分contigs之间的空隙，是一个比较合理和经济的测序策略。

目前正在兴起的第三代测序是单分子测序，这种技术无需PCR扩增，这种方法测序通量更高，操作过程更简单，成本更低。另外它还具有3个显著的特点：第一，单分子测序技术可以直接对RNA进行序列，这样大幅度降低体外逆转录产生的系统误差；第二，可以直接检测甲基化的DNA序列，为表观遗传学研究奠定了基础；第三，可以对特定序列的SNP进行检测，实现对稀有突变及其频率的测定。

基因组组装是一个非常复杂的过程，对于新一代测序所产生的海量数据（通常有上亿以上的reads），就需要借助于高性能计算服务器来进行处理，而合适有效的算法对大批量的reads组装来说就显得非常重要，一个好的组装方法不仅可以使得其速度加快，而且保证它的准确率。目前主要有3种方法进行组装：贪婪组装法（greedy算法）、Overlap/layout/consensus 法和Debjujin构图法（欧拉算法）。基因组草图组装完成后, 可利用生物信息学方法对基因组进行分析和注释, 为后续功能基因组研究提供丰富的资源。例如, 可以通过GeneScan、Fgene SH等工具发现和预测基因；利用BLAST 同源序列比对或InterProScan结构域搜索等方法对基因进行注释；利用GO分析对基因进行功能分类；利用KEGG对代谢途径进行分析等。

三、中药材DNA条形码鉴定技术

中药资源种类有12000余种，地区用药差异明显，中药来源复杂，品种众多，影响中药临床疗效的稳定性。由于传统方法在中药材的物种鉴定上有着很大的局限性，加之历代本草记载的差异和不同地区用药习惯等原因，存在部分中药材同名异物、同物异名现象，给中药临床应用带来极大挑战，如：2000年的马兜铃酸肾病事件，主要由含马兜铃酸的关木通和广防己误当不含马兜铃酸的木通和粉防己使用造成；有毒土三七误当三七使用引起肝损害；亚香棒虫草混入冬虫夏草引起头晕、呕吐、心悸等混伪品问题时有发生。

DNA条形码（DNA barcoding）鉴定是分子鉴定的最新发展，即通过比较物种中的一段通用的DNA片段，对物种进行快速、准确的识别和鉴定。DNA条形码作为新的分子鉴定技术用于物种鉴定有着其他分子标记技术无法比拟的优势：（1）只需选用一个或少数几个合适的基因片段即可对整个属、科甚至几十个科的绝大部分物种进行准确的鉴定；（2）鉴定过程更加快速，可以在短时间内鉴定大量的样本；（3）重复性和稳定性高；（4）试验过程标准化，操作简单，更容易实现物种鉴定的自动化；（5）运用DNA条形码鉴定物种可以缓解分类鉴定人才缺乏的现状；（6）通过互联网和信息平台可以对现有物种的序列信息在全球范围内集中统一管理并全球共享，有利于构建更系统、更完整的DNA条形码信息数据库。该方法由于不受环境因素的影响以及样品形态和材料部位的限制，可为中药原植物和中药材品种鉴别提供准确依据。

DNA条形码鉴定包括通用序列的筛选(图2)、样品的收集、DNA提取、PCR扩增、DNA条形码的获取及结果判定。

四、中药质量生物效应评价技术

中药质量生物效应评价是以中药临床功效为基础，采用定量药理学和药物分析学方法定性定量表征中药生物效应的评价方法，从而达到控制或评价中药内在质量及其一致性和优质性和安全性的目的，可利用整体动物、离体组织、器官、细胞、微生物、功能酶、受体等为试验系。按研究对象、测定方法及评价目的不同，生物效应评价方法可分为生物活性测定、生物效（毒）价测定等方法。随着基因组学、蛋白组学、代谢组学等系统生物学的发展及其在中医药领域中的应用，生物标志物和生物效应表达谱检测将成为中药质量生物评价与控制的重要手段和方向。

将生物效应评价技术用于中药资源领域，对于成分复杂、药理作用多样的中药及制剂的质量控制与评价来说具有独特的优势，有效避免仅控制少数指标性成分难以评价中药质量或难以反映疗效的问题。中药质量生物效应评价是在现有质量标准控制体系的基础上，引入生物评价方法和指标，以期从常规、化学、生物等多角度控制与评价中药质量。生物效应评价与现有质量控制体系更多是相辅相成、互为补充的。生物效应评价是继性状评价、化学评价之后，推动中药质量标准走进临床、关联疗效的有效途径和手段，《中国药典》从2010年版开始收录了“中药生物活性测定指导原则”，现在已成为了中药质量标准化研究的重要方向之一。

五、中药效应成分指数

中药效应成分指数（Effect-constitute Index of CHM，ECI）是肖小河教授团队首创的一种中药质量综合量化集成评价方法，即基于效应校正的中药多成分测量。它整合化学检测和生物评价的技术优势，既关联中药临床功效和安全性，同时易于检测评价、可操作性好，同时也较好地反映中药多成分综合发挥疗效的特点，克服了目前中药质量评控指标“碎片化”和难以关联功效等局限性，尤适合于化学背景相对明晰的中药。一般来说，中药的效应成分指数越高，其质量相对更佳；中药的毒性成分指数越低，其安全性更好。

一、创设分子生药学学科

自1995年以来，20年间，分子生药学学科已走过萌芽期、形成期、快速发展期，进入相对成熟期，形成了覆盖全国的分子生药学科研机构和学术队伍，逐步建立了面向本科-硕士-博士研究生以及在职人员的纵向多层次学科教学体系，初步培育了由实验室-重点学科-学术期刊支撑的多元化的学科平台。

近20年来，分子生药学教学从无到有，已形成了相对独立的学科教学体系，本科、研究生教学规模不断扩大。2001年，北京中医药大学和沈阳药科大学分别开展了分子生药学本科和研究生教学。2008年，黄璐琦、肖培根共同主编的新世纪全国高等中医药院校创新教材《分子生药学》由中国中医药出版社出版，目前国内20余所高等院校针对本科或研究生开设了分子生药学课程。自2012年起，在国家中医药管理局分子生药学继续教育重点项目的支持下，中国中医科学院中药资源中心联合中医药院校举办分子生药学暑期研修班活动，先后有380余名研究生和青年教师代表参加了研修班活动，促进了分子生药学教学和科研水平，推动了分子生药学学科的发展。

二、首次出版《分子生药学》

2000年，黄璐琦主编的《分子生药学》第一版由北京医科大学出版社出版，标志着分子生药学在国内诞生，该书陆续成为复旦大学、北京大学和华西医科大学等高校的研究生教材，得到了广大师生的好评，并获得中医药专家的高度评价。正如谢宗万教授对分子生药学的评价:“《分子生药学》的出版，是新思想、新方法、新技术在中药和生药领域里的扩大应用，使我国生药学上了一个新台阶”。中国工程院院士肖培根在为《分子生药学》一书写作的序中这样说:“以黄璐琦教授为代表的我国年轻一代的生药学科技工作者，以他们的敏锐洞察力预见到将先进的分子生物学的原理和方法引入到传统生药学科的重要性和必要性，并倡导提出它可以成为生药学学科中的一个分支学科”。于2006年出版的《分子生药学（第二版）》，2010年获得中华中医药学会著作奖一等奖。2015年，黄璐琦与刘昌孝院士共同主编的《分子生药学（第三版）》出版，该书对分子生药学成果进行了系统的梳理和总结，在领域内外取得了广泛的关注。2012 年《分子生药学(英文版)》在Springer 出版社发行，该书的出版，标志分子生药学获得了国际的认可。

三、栝楼属植物的系统演化及其药材的分子鉴定研究

栝楼属（Trichosanthes L.）是葫芦科（Cucurbitaceae）植物中一个比较大的属，共有植物80多种，其分布地区为东亚及澳大利亚北部，我国有一半的种类。然而，自1753年该属建立以来，没有人对栝楼属进行世界范围的广泛深入的研究，以致共出现学名193个，存在着严重的同物异名和误定现象，特别是栝楼这一复合种，被葫芦科专家C. Jefferey（1980）称为"东亚地区葫芦科中最难处理的分类学难题（the most intractable taxonomic problem in eastern Asia Cucurbitaceae），这种混乱现象已严重影响到该属药材的使用。黄璐琦等人通过广泛的野外调查和从国内外主要标本馆借阅标本，在经典形态分类的基础上，重点应用孢粉学、分子生物学、细胞学及化学等领域的国际先进手段来研究世界范围本属的分种，属下划分及系统演化问题，同时探索性地在中药材鉴定中运用分子生物学的方法进行研究。研究确立了世界范围内栝楼属植物84种8变种，我国有37种6变种，提出了一个新的属下分类系统，而且应用分子系统学的方法研究其系统演化趋势，为在该属植物中寻找新的药源提供了依据，如寻找类似天花粉蛋白活性的新蛋白应在叶苞系植物中筛选；并对常用中药天花粉和瓜蒌的原植物来源，提出了新的见解；应用分子生物学技术，为鉴别栝楼雌雄株和天花粉类药材提供了新的方法。该研究是241年来第一次对世界范围的栝楼属植物进行全面系统的整理和修订，为这一领域研究填补了空白。该项研究被专家鉴定为对世界性栝楼属植物及药材最为全面而系统的研究，取得了创造性成果，达到国内领先国际先进水平。通过该项目的研究，完成了《中国植物志》（英文版）栝楼属的编写工作；有关天花粉来源的研究成果，也已被《中国药典》采用。该研究获2003年国家科学技术进步奖二等奖

四、蛇类饮片PCR鉴定方法成为首次纳入《中国药典》

中药分子鉴定是分子生药学最初研究任务,2000 年之后,中药分子鉴定快速发展。黄璐琦等应用Cytb 序列对蕲蛇和乌梢蛇设计特异引物进行PCR 扩增鉴别,同时将该方法首次正式写入2010年版《中华人民共和国药典》,并研制了相应的鉴别试剂盒供中药质检部门使用。该方法申请的“高特异性聚合酶链式反应技术鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法”（专利号：200410006374.0）获得国家知识产权局第十二届中国专利奖优秀奖。

与此同时,相关中药分子鉴定专著相继出版。例如，2010 年黄璐琦和胡之壁主编《中药鉴定新技术新方法及其应用》，系统介绍了中药分子鉴定的原理和方法,开展了一系列卓有成效的分子鉴定工作；2012 年陈士林出版了《中药DNA 条形码分子鉴定》；2014年黄璐琦等主编《中药分子鉴定操作指南》全面系统的介绍了中药分子鉴定技术的理论、技术和操作规程。

五、灵芝等多个药用植物基因组测序完成并公开发布

2010年启动的本草基因组计划 (Herb Genome Program, HerbGP) 是针对具有重要经济价值的药用植物和代表不同次生代谢途径的模式药用植物开展的基因组层面的系列研究。主要内容包括全基因组序列测定、组装和生物信息学分析，及具有典型次生代谢途径的模式药用植物研究平台的建立和抗病抗逆等优良性状遗传机制的阐明等后基因组学研究，同时包括利用基因组学信息对药用植物的品种选育。目前，灵芝、丹参、茯苓、云芝、紫芝、石斛、莲、赤小豆等药典收载物种已经完成基因组测序并发表。

利用高通量测序技术对单倍体灵芝的基因组进行了测序，并利用光学图谱技术辅助基因组组装，获得了染色体水平的灵芝基因组精细图，并根据基因组解析结果首次提出将灵芝作为药用模式真菌。灵芝基因组精细图的完成，为灵芝功能基因学研究和灵芝三萜等次生代谢产物的合成及调控研究奠定了基础。

朱英杰等基于物理图谱构建了紫芝的12条染色体，通过高通量测序方法得到48.96Mb的紫芝基因组序列。首次从组学角度揭示了灵芝中的表观遗传学调控机制，包括DNA甲基化和小RNA。对紫芝基因组中参与次生代谢的基因簇进行了预测，共发现超过三十个次生代谢产物合成相关基因簇，其中包括NRPS、PKS、TPS基因簇，这些基因簇在紫芝和赤芝之间相对保守。紫芝中发现了237个细胞色素P450（CYP）基因，紫芝和赤芝CYP基因家族的差异很可能是导致它们化学成分差异的因素之一。基因组防御是一种特殊的基因组自我保护机制，紫芝基因组测序剖析了DNA甲基化、重复序列诱导的点突变（RIP）以及小RNA可能参与的基因组防御作用。

六、中药材DNA条形码鉴定技术体系建立并纳入《中国药典》

国际上首次提出并验证ITS2序列作为植物通用DNA条形码，被公认为中草药鉴定的最优条形码。建立了基于ITS2序列为主体psbA-trnH为补充的植物类药材DNA条形码鉴定技术体系及基于COI和ITS2序列的动物类药材DNA条形码鉴定。建立了全球最大的中药材DNA条形码鉴定数据库，包含100余万条DNA序列，可实现对中国、美国、日本、欧盟、韩国和印度等国药典收载的几乎所有草药物种快速鉴定。中草药DNA条形码鉴定技术已被美国、英国等药典委员会专家接受，并委派鉴定专家到项目组研修和交流。中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则列入中国药典2015版。

（黄璐琦、肖小河、陈士林、段金廒、周荣汉、刘勇、袁媛、李西文、郭娟、王伽伯、彭勇）