目的：建立简单、准确的虻虫DNA分子标记鉴别方法。方法：扩增并分析虻虫及7种常见伪品的细胞色素C氧化酶I亚基基因（COⅠ）序列，根据差异片段设计聚合酶链反应-限制性内切酶酶切长度多态性（PCR-RFLP）引物，使用限制性内切酶进行酶切鉴别。结果：引物对MengChong-Dig.F/MengChong-Dig.R可扩增虻虫及其伪品COⅠ序列，产生约490 bp条带，限制性内切酶Dra Ⅰ可以识别虻虫及其伪品的差异序列，仅虻虫的COⅠ片段可被酶切形成两个片段，从而特异性鉴别是否为虻虫。结论：本实验建立的PCR-RFLP可以作为虻虫的DNA鉴定方法。
虻虫的PCR-RFLP鉴别研究
蒋超， 李军德，袁媛* ， 金艳， 赵玉洋
( 中国中医科学院 中药资源中心， 北京 100700)
虻虫为虻科动物复带虻Tabanus bivittatus Matsumura 等的雌虫体（2015年版《中华人民共和国药典》四部），始载于《神农本草经》，具有调经破血、消癓软坚的功能。中医临床用于经闭、淤血作痛、跌仆损伤等病症[1]。虻虫雌虫吸食牛、马等动物血液，亦吸食人类血液。虻虫为少常用中药，随着经济的发展，个体化动物养殖减少，虻虫资源蕴藏量处于下降趋势。市场上虻虫类基源动物来源也日趋复杂，除复带虻外，同科虻属、黄虻属、麻虻属、瘤虻属多种虻虫也广泛应用。同时，作者对玉林、安国、毫州等大型药材市场调查发现，蜜蜂科昆虫中华蜜蜂Apis cerana Fabricius、意大利蜜蜂A.mellifera ligustica Spin.，熊蜂属(Bombus)昆虫，胡蜂科(Vespidae)昆虫的各类成虫炮制后与虻虫形态相似，常充伪虻虫出售，甚至蝇科(Muscidae)家蝇Musca domestica Linnaeus、麻蝇科(Sarcophagidae)麻蝇、丽蝇科(Calliphoridae)丽蝇等多种蝇类也常掺杂其中，严重影响了药材质量。目前虻虫一般通过形态学和显微鉴定[2-3]，对于缺头少尾的虻虫市售药材鉴定困难，亟待客观化和标准化。
近20年来，DNA分子标记技术已应用于中药的真伪鉴定与质量评价等相关研究[4-6]。聚合酶链反应-限制性内切酶酶切长度多态性(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymirphism，PCR-RFLP)将PCR与DNA序列分析相结合，通过PCR扩增获得目的片段，以合适的限制性内切酶对目的片段进行RFLP分析，从而产生特定酶切图谱。PCR-RFLP及其变种已广泛用于动植物中药的真伪鉴别[7-10]，2015版《中华人民共和国药典》收载的川贝母PCR分子鉴别方法也为本法。本研究将我国常见的11种虻虫与7种市场常见伪品进行PCR-RFLP鉴定，以期为中药虻虫药材的分子鉴定提供依据。
1仪器与试药
1.1仪器
PCR仪:VeritiTM型(Applied Biosystem公司)、GeneAmp9700型(Applied Biosystem公司)、PTC-100型(Gene公司)；5810R型高速冷冻离心机(Eppendorf公司)；VORTEX-2GEN1E旋涡震荡仪(Scientific industries公司);PowerPacTM型电泳仪(Bio-Rad公司);HE99X-15-1.5型电泳槽(Hoefer公司);SYNGENE凝胶成像系统(GENE公司)。
1.2材料
选取来自于不同产地的12种虻虫及7类伪品共143份材料进行PCR-RFLP鉴别研究。虻虫类样品由军事医学科学院许荣满研究员提供并鉴定，其余样品采自安徽毫州、广西玉林、成都荷花池等药材市场，凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心。见表1。
1.3表1实验材料详表试剂
Wizard SV Genomic DNA Purification System试剂盒(Promega公司);Taq DNA聚合酶:Ex Taq (Takara公司)、SpeedStar HS Taq(Takara公司)、Q5 Taq DNA聚合酶(NEB公司)；琼脂糖(Promega公司)；10000×Genegreen核酸染料(TianGen公司)；DL2000 DNAMarker(Takara公司)；DraⅠ限制性内切酶(NEB公司、Takara公司、Thermo公司)；其他试剂均为国产分析纯。
2实验方法
2.1引物设计
2.1.1虻虫序列获得 从NCBⅠ数据库(National Center for Biotechnology Information)中下载虻虫(DQ983533.1、DQ631993.1)及人(JN034122.1)、猪(JN850781.1)、牛(JX218067.1)、羊(KT750038.1)等动物的COⅠ序列，使用Clustal W程序进行多重序列比对，选择虻虫特异性序列区域，使用Premier Primer 5.0(http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/)设计特异性PCR引物。PCR产物长度为500-700bp，Tm值为55-65℃。引物命名为MengChong-1.F和MengChong-1.R，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，见表2。使用虻虫特异性PCR引物扩增收集的虻虫及其伪品材料，阳性PCR产物使用Sanger测序法进行双向测序，序列经CodonCodeAligner5.1.2拼接后用于酶切位点分析。
2.1.2酶切位点分析 使用ClustalW程序对测序获得的虻虫序列和虻虫伪品序列进行多重序列比对，寻找其差异区域，使用在线软件WatCut (http://watcut.uwater100.ca/template.php?act=snp_new) 分析正伪品间差异酶切位点，寻找正伪品间具有差异的单一酶切位点进行PCR-RFLP分析。PCR-RFLP分析的扩增引物通过Premier Primer5.0设计，调整上下游引物位置，使扩增产物位于300-500bp，引物命名为MengChong-Dig.F和MengChong-Dig.R，见表2。
2.2基因组总DNA的提取
取虻虫类样品，使用Retsch MM400球磨粉碎至能过80目筛，取10mg粉末，使用Wizard SV Genomic DNA Purification System 试剂盒按说明书进行DNA提取。
2.3PCR-RFLP分析
2.3.1PCR扩增 使用引物MengChong-Dig.F和MengChong-Dig.R对虻虫及其混伪品进行PCR扩增，在200μL离心管中进行PCR反应。反应总体积为25μL，包括10×PCR buffer2.5μL、dNTP(2.5mmol.L-1)1.5μL、Taq DNA聚合酶(5U.L-1)0.4μL和DNA模板1μL，上下游引物各0.5μL，用无菌双蒸水补足反应体积。PCR反应在VeritiTM型PCR扩增仪上进行。反应程序见表2。取PCR反应产物5μL，加入2μL6×Loadingbuffer(Takara公司)，混匀后于Genegreen染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE凝胶成像系统观察、成像。
2.3.2 RFLP分析 另取虻虫及其混伪品PCR产物进行RFLP分析，酶切反应体系为20μL，包含10×Buffer2μL、PCR产物15μL、DraⅠ限制性内切酶(10U.μL1)0.5μL、ddH02.5μL，酶切反应在32℃水浴反应1h。取PCR反应产物5μL，加入2μL6×Loading buffer(Takara公司)，混匀后于Genegreen染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测、成像。
2.3.3条件考察 引物MengChong-Dig.F和MengChong-Dig.R对虻虫及其混伪品进行PCR扩增，使用DraⅠ限制性内切酶进行RFLP分析，并分别考察退火温度、PCR循环数、模板DNA浓度、变性和退火时间、Taq种类、不同PCR仪、不同品牌DraⅠ限制性内切酶、 酶切时间对 PCR反应稳定性的影响。
3 结果与分析
3.1虻虫 PCR-RFLP引物的设计
使用 引 物 MengChong-1.F和MengChong-1.R扩增虻虫及其伪品东方蜜蜂、 西方蜜蜂、 熊蜂、 胡蜂、 家蝇、 麻蝇、 丽蝇 COⅠ序列，序列比对后进行 SNP- RFLP分析， 结果表明，在序列 263-267 位存在 T/C、T/A、A/T等 SNP位点， 其中虻虫分别为 T、 T、 A，此位 点 位 于 Dra Ⅰ限制性内切酶识别序列( 5'- TTTAAA-3') 上，使得虻虫可被切开，混伪品无法切开，并且此位点在COⅠ序列唯一，见图1。
3.2虻虫PCR-RFLP分析
对12种虻虫及7类伪品使用虻虫鉴别引物进行扩增，正伪品均获得496bp的扩增产物。利用限制性内切酶DraⅠ进行酶切，虻虫序列具TTTAAA酶切位点，而产生265bp和231bp的两条条带，伪品因存在SNP位点导致酶切位点丢失，酶切前后条带不变，见图2。
3.3条件考察
PCR扩增和限制性内切酶酶切均可能影响虻虫鉴别效果，本文对影响PCR扩增的关键因素退火温度、循环数、DNA浓度以及影响酶切结果的限制性内切酶时间等进行系统考察，同时考察筛选的条件对不同Taq DNA聚合酶、不同内切酶及不同PCR扩增仪的耐受性，结果表明，退火温度位于52-58℃，循环数30-40、DNA模板浓度8-200ng.μL-1、Taq酶用量在0.5-2U时、酶切时间在15min-4h时均可准确鉴别虻虫及其常见伪品，见表3。在此条件下对不同保真度的Taq酶、不同型号PCR仪以及不同品牌DraⅠ限制性内切酶均具有稳健性;退火温度过高(>58℃)、循环数过少(<30)、模板浓度过低(<8ng.μL-1)易产生假阴性结果;而酶切时间过长则会产生星活性，导致假阳性结果，见表3。
3.4方法的适用性考察
采用上述确定的优化体系，对102批虻虫样品及41批伪品进行PCR扩增，不同种类、来源虻虫均可产生约490bp条带，经DraⅠ酶切后，正品均产生大小约为230bp和260bp的两条条带，而虻虫伪品均无法酶切，表明该体系能稳定、准确地鉴别虻虫。
4分析与讨论
虻虫为少常用药材，历来有多种来源，《中华人民共和国药典》规定的虻虫来源为复带虻等;《全国中草药汇编》规定为复带虻或鹿虻T.chrysurus Loew;《中药大辞典》规定为虻科昆虫复带虻或其他同属昆虫;而《中华本草》则规定为华虻T.mandarinus Schiner及其同属昆虫以及黄虻属双斑黄虻(复带虻)。说明虻虫为多来源性药材，多种虻虫均可人药。随着资源的稀缺，市场上虻虫主流药材基源不断流变，早期以华虻为主流，后发展为华虻、姚虻、复带虻[3,11]。近期李军德等对全国多个省份商品药材样品鉴定表明，除云南、北京、辽宁、内蒙古约有2%-5%的复带虻T.bivlttatus外，其余主要为汉斯虻、广西虻、杭州虻等[12]。作者近期对全国几个大型中药市场调查发现，市场及临床使用不区分虻虫种类，伪品主要为中华蜜蜂、意大利蜜蜂、熊峰、麻蝇等形态类似的昆虫，这些昆虫不具有破血消癓的功能，需要与虻虫进行鉴别。为达到准确鉴定虻虫的目的，本研究收集了杭州虻、广西虻等12种市场常见虻虫品种及主要伪品进行DNA分子鉴定研究。
为建立DNA分子鉴别方法，首先需要进行分子标记的获得与筛选。由于虻虫为吸血性昆虫，常吸食牛、马等动物血液，直接使用COⅠ片段通用引物无法获得虻虫序列。本研究首先设计一对虻虫类特异性引物对虻虫及膜翅目、双翅目部分昆虫进行了COⅠ基因的扩增和测序，发现仅虻类昆虫含DraⅠ限制酶识别序列，从而建立PCR-RFLP鉴别方法用于虻虫与混伪品的鉴别。为保证PCR-RFLP方法的稳定性，笔者对退火温度、PCR循环次数、DNA浓度、引物用量、DNA聚合酶用量、PCR仪和DNA聚合酶等进行考察，并同时考察了酶切结果的稳定性。结果表明，在长时间酶切的情况(4h以上)下可能产生星活性，导致伪品出现部分的酶切，但不会影响判别结果，见图3。使用该方法对市售的73批虻虫进行鉴别均能获得正确的酶切鉴别结果。本实验将PCR-RFLP方法引人虻虫的真伪鉴别中，表明该技术具有准确、简便、重复性好等特点，能有效鉴别虻虫及其伪品。同时该方法对样品要求低，对炮制、仓储样品均具有良好的鉴别效果，有望成为商品虻虫的特异性鉴别方法。
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END
声明：本文转载自中国现代中药（蒋超,李军德,袁媛,金艳,赵玉洋.虻虫的PCR-RFLP鉴别研究[J].中国现代中药,2017,19(1):16-20
